Senin, 20 Desember 2010

Imunodiagnostik dan Serologi Pada Infeksi Mikroba

Pada laboratorium mikrobilogi klinik, pembiakan mikroorganismee dari specimen pasien masih merupakan metoda yang digunakan untuk penyakit infeksi. Pada tahun 1940 dan 1950an dikembangkan teknik serologi seperti teknik Oudin dan imunodifusi Ouchterlony. Kemudian setelah itu mulai berkembang metode lain yang didasarkan kepada konsep immunologi, seperti fiksasi komplemen, yang diperkenalkan sebagai metode yang dapat menentukan respon imun seseorang terhadap infeksi. Pemeriksaan seperti radioimmunoassay, enzyme assays dan teknik hibridoma meningkatkan peranan pemeriksaan serologis untuk penyakit infeksi.

Respon imun spesifik secara sederhana dibagi dalam 2 kategori yaitu: respon yang dimediasi oleh sel dan respon yang dimediasi oleh antibodi. Respon imun yang dimediasi oleh sel dibawakan oleh sel limfosit T. Limfosit T berproliferasi dan berdifferensiasi menjadi beragam sel efektor, termasuk sel T helper dan sel T sitotoksik. Sel T sitotoksik secara spesifik menyerang dan membunuh mikroorganismee pada sel hospes yang rusak atau karena terinfeksi pathogen. Sel T helper memproduksi sitokin, sitokin merangsang pematangan sel B sehingga sel B memproduksi antibodi yang mampu membunuh organisme yang mengifeksi.

Respon imun yang dimediasi oleh antibodi adalah merupakan protein spesifik yang dihasilkan oleh limfosit B. karena protein bersifat menimbulkan reaksi fungsi imunologis dan memiliki struktur globular pada keadaan aktif maka disebut juga immunoglobulin.

Antibodi disekresikan ke dalam darah atau cairan limpa (kadangkala pada cairan tubuh lainnya) oleh sel B limfosit, atau tetap melekat pada permukaan sel limfosit atau sel lain. Karena sel yang terlibat dalam kategori respon imun ini berada dalam sirkulasi darah, tipe imunitas seperti ini disebut juga imunitas humoral. Untuk keperluan penentuan antibodi pada pasien yang telah diproduksi ketika proses melawan infeksi, serum pasien (atau kadangkala plasma) diperiksa untuk mengetahui adanya antibodi. Mempelajari diagnosa suatu penyakit berdasarkan penentuan kadar antibodi dalam serum disebut serologi.

Karakteristik Antibodi.

Secara genetik manusia memilki kemampuan untuk memproduksi secara langsung antibodi spesifik terhadap hampir semua jenis antigen, baik melalui kontak selama hidup dan oleh pengenalan tubuh sebagai benda asing. Antigen dapat berupa bagian struktur fisik atau bahan kimia yang diproduksi dan dilepaskan oleh pathogen misalnya eksotoksin. Satu pathogen dapat mengandung atau memproduksi banyak antigen yang berbeda-beda yang dapat dikenali oleh hospes sebagai benda asing, sehingga infeksi oleh satu agent penyakit dapat menimbulkan produksi antibodi yang berbeda-beda. Sebagai tambahan, beberapa antigen memiliki sifat tidak dapat dikenali oleh sel hospes apabila antigen tersebut tidak melalui proses perubahan fisik, sebagai contoh sebelum bakteri pathogen dicerna oleh leukosit polimormonuklear, beberapa antigen pada permukaan sel tidak dapat dikenali oleh sistem imun, sekali bakteri tersebut pecah, antigen inilah yang akan dikenali sehingga terbentuk antibodi untuk melawan antigen tersebut. Berdasarkan alasan tersebut pasien dapat memproduksi antibodi yang berbeda pada saat infeksi oleh satu jenis penyakit. Respon imun akan semakin matang dengan adanya paparan yang berulang, dan antibodi yang terbentuk akan lebih spesifik dan lebih dapat terikat dengan kuat.

Antibodi bekerja dengan jalan:

1). Melekat pada permukaan pathogen dan membuat pathogen lebih dapat diterima oleh sel fagosit (opsonisasi antibodi)

2). Berikatan dan menghalangi reseptor permukaan pada sel hospes (antibodi netralisasi)

3). Melekat pada permukaan sel pathogen dan berperan dalam penghancuran dengan aktifitas lisis sistem komplemen (fiksasi komplemen antibodi).

Meskipun metode diagnostik serologi rutin biasanya hanya mengukur dua kelas antibodi yaitu IgM dan IgG, terdapat lima kelas antibodi yang berbeda yaitu : IgG, IgM, IgE, IgA dan IgD. Pada struktur antibodi terdapat tempat melekatnya antigen (antigen binding site), yang bersifat spesifik pada setiap antibodi yang terbentuk. Berdasarkan spesifitas antibodi, antigen dengan beberapa kesamaan tetapi tidak identik, dapat berikatan pula dengan antibodi, disebut dengan reaksi silang. Komplemen-binding site terletak ditengah-tengah struktur molekul dan semua sama pada setiap kelas antibodi. IgM merupakan respon pertama untuk beberapa antigen, walaupun jumlahnya yang tinggi hanya bersifat sementara. Sehingga dengan adanya IgM menandakan bahwa baru terinfeksi atau permulaan infeksi aktif. Dilain pihak IgG merupakan antibodi yang dapat tetap bertahan lama sampai setelah infeksi hilang. Struktur molekul IgM terdiri dari lima monomer antigen dengan sepuluh antigen –binding site.

Respon imun humoral yang bermanfaat dalam pengujian diagnostik

Sistem imun manusia mampu memproduksi baik antibodi IgM atau IgG dalam hampir semua pathogen. Pada kebanyakan kasus, IgM diproduksi oleh pasien hanya setelah interaksi pertama dengan pathogen dan tidak lagi terdeteksi setelahnya dalam waktu singkat. Untuk kepentingan diagnosa secara serologis, perbedaan yang penting dari IgM dan IgG adalah IgM tidak dapat menembus plasenta dari ibu hamil, sehingga apabila IgM terdeteksi pada serum bayi baru lahir, pasti telah dibuat oleh bayi itu sendiri. Dengan molekul yang besar dan jumlah antigen-binding site IgM dapat membantu mempercepat melenyapkan pathogen.

IgG merupakan antibodi yang lebih spesifik terhadap antigen, walaupun IgG hanya memiliki dua antigen binding site, tapi dapat pula terikat pada komplemen. Ketika IgG terikat pada antigen, dasar molekul akan melekat dan terikat pada membran sel fagosit, meningkatkan kemampuan menelan dan penghancuran pathogen oleh sel hospes. Pertemuan kedua dengan antigen yang sama biasanya hanya menimbulkan respon IgG. Karena sel B limfosit menyimpan sel memori dari pathogen tersebut, sehingga dapat lebih cepat merespon dan lebih banyak dihasilkan antibodi dibandingkan dengan interaksi pertama. Respon cepat tersebut dinamakan respon anamnestik. Karena sel B memori tidak sempurna, kadangkala kelompok sel memori akan distimulasi oleh antigen yang mirip tapi tidak sama seperti antigen asal, yang menimbulkan respon anamnestik poliklonal dan tidak spesifik. Sebagai contoh infeksi ulang cytomegalovirus akan menstimulasi sel B memori untuk memproduksi antibodi terhadap virus Eipstein-Barr (family virus herpes lainnya).

Interpretasi pada pemeriksaan serologi

Pemahaman umum dari konsep serologi adalah terjadinya peningkatan titer. Titer antibodi sebanding dengan pengenceran tertinggi serum pasien dimana antibodi masih dapat terdeteksi. Pasien dengan jumlah antibodi yang tinggi, karena antibodi masih dapat terdeteksi pada pengenceran tertinggi, serum yang digunakan untuk penentuan titer antibodi harus diambil selama fase akut dari penyakit (ketika pertama kali diketahui atau masih tersangka) dan diulangi selama masa penyembuhan (biasanya dua minggu kemudian). Specimennya disebut serum akut dan serum konvalesen. Untuk beberapa infeksi, seperti penyakit legionnaire’s dan hepatitis, titer dapat tidak meningkat sampai beberapa bulan setelah infeksi akut atau dapat tidak pernah meningkat sama sekali. Untuk kebanyakan pathogen, peningkatan titer dari pengenceran empat kalinya (yaitu dari positif pada titer 1/8 menjadi 1/32 pada serum berpasangan (akut dan konvalesen), dapat dipertimbangkan didiagnosa sebagai infeksi baru. Hasil yang akurat untuk diagnosa penyakit infeksi ini akan didapatkan hanya ketika serum akut dan konvalesen diperiksa bersama-sama dalam sistem pengujian yang sama.

Prinsip-prinsip pemeriksaan metode serologis

Penentuan antibodi dapat dilakukan dengan berbagai cara. Dalam beberapa kasus antibodi terhadap satu jenis antigen dapat diperiksa dengan lebih dari satu cara tetapi metode penentuan antibodi yang berbeda terhadap satu antigen boleh jadi mengukur antibodi yang berbeda. Berdasarkan alasan tersebut adanya antibodi terhadap pathogen tertentu yang dideteksi oleh satu metode mungkin saja tidak berhubungan dengan adanya antibodi terhadap antigen yang sama tapi dengan metode yang berbeda. Kemudian pula setiap metode pemeriksaan memiliki derajat sensitifitas yang bervariasi dalam mendeteksi adanya antibodi. Walaupun demikian, karena IgM biasanya diproduksi hanya pada pasien dengan infeksi pertama kali terhadap agent infeksi, penentuan IgM dapat membantu klinisi dalam penentuan diagnosa, sehingga kebanyakan metode serologis didasarkan kepada analisa IgM.

Pemeriksaan IgM untuk pemeriksaan serologis

Pemeriksaan IgM berguna khususnya untuk penyakit yang memiliki gejala klinik yang tidak jelas, misalnya toksoplasmosis atau untuk penyakit yang memerlukan keputusan pengobatan yang cepat contohnya infeksi rubella pada wanita hamil yang dapat berakibat tidak baik bagi janin seperti katarak, glukoma, keterbelakangan mental, dan ketulian. Sehingga untuk wanita hamil yang terinfeksi virus rubella dan mengalami sakit demam dapat dlakukan pemeriksaan terhadap IgM antirubella. Apabila positif dapat diajukan pilihan untuk menghentikan kehamilan.

Agent yang sulit dibiakan atau hanya dapat ditemui saat stadium dewasa selama siklus hidupnya seperti Treponema pallidum, cytomegalovirus, virus herpes, Toxoplasma atau Rubella, biasa digunakan pemeriksaan IgM, dan telah dikelompokkan dalam satu pemeriksaan STORCH (syphilis, Toxoplasma, Rubella, Cytomegalovirus dan Herpes). Tes ini dilakukan secara terpisah tergantung gejala klinik pada bayi baru lahir. Akan tetapi kadangkala pada bayi yang terinfeksi terlihat sehat. Demikian pula pada beberapa keadaan biasa terjadi positif palsu atau negatif palsu dalam pemeriksaan serologis, sehingga berbagai pertimbangan termasuk kondisi klinis harus disertakan pada infeksi neonatal dan teknik pembiakan pada beberapa kasus masih merupakan metode yang dipercaya untuk diagnosa penyakit.

Pemisahan IgM dari IgG diperlukan untuk metode pemeriksaan yang menggunakan IgM sebagai marker yang diberi label, misalnya metode IgM capture sandwich. IgM dahulu dapat dipisahkan dengan metode sentrifugasi kecepatan tinggi. Metode lain yang digunakan untuk memisahkan IgG dan IgM didasarkan pada kenyataan bahwa protein permukaan staphylococcus (proteinA) dan streptococcus (protein G) terikat pada bagian Fc dari IgG . dengan sentrifugasi dan pemisahan partikel dan ikatan IgG dari campuran maka akan didapatkan IgM. Metode lainnya yang dapat digunakan untuk memisahkan IgM dari serum yang mengandung IgG dan IgM adalah dengan penambahan rheumatoid factor. Antibodi IgM diproduksi oleh beberapa pasien bersama-sama IgG, rheumatoid factor berikatan dengan IgG sehingga IgM dapat dipisahkan dari IgG.

Metode pemeriksaan antibodi

A. Metode aglutinasi

Reaksi aglutinasi (direk atau pasif) banyak digunakan, sebagai contoh penentuan tipe eritrosit dalam penggolongan darah, diagnosis imunologi pada penyakit hemolitik seperti anemia hemolitik yang diinduksi obat, tes rheumatoid faktor (IgM dan IgG), tes untuk syphilis dan aglutinasi untuk tes kehamilan.

Contoh reaksi aglutinasi pada pemeriksaan Golongan darah

Pada reaksi aglutinasi bakteriologis, dasar pemeriksaan penentuan antibodi adalah pengukuran antibodi yang terbentuk yang merupakan respon terhadap antigen. Antibodi spesifik melekat pada permukaan bakteri dalam suspensi yang kental sehingga menyebabkan bakteri berkumpul membentuk agregat. Antibodi yang demikian disebut dengan aglutinin dan pemeriksaannya disebut aglutinasi bakteri. Reaksi aglutinasi biasa dilakukan untuk infeksi bakteri yang sulit dilakukan pembiakan secara in vitro. Bakteri yang menggunakan teknik ini diantaranya: tetanus, yersiniosis, leptospirosis, brucellosis, dan tularemia. Demam thypoid agglutinin test (Widal test) sudah jarang digunakan karena biasa bereaksi positif pada pasien dengan infeksi bakteri lain atau reaksi silang antibodi atau karena pernah imunisasi thypoid. Pemeriksaan yang paling sesuai untuk pasien tersangka demam thypoid adalah dengan pembiakan dan identifikasi adanya bakteri Salmonella. Sel parasit Plasmodium, Leismania atau Toxoplasma gondii, juga telah menggunakan metode aglutinasi langsung untuk deteksi antibodi. Banyak pasien yang terinfeksi ricketsia memproduksi antibodi yang dapat menyebabkan aglutinasi non spesifik terhadap bakteri proteus. Tes Weil-Felix dapat digunakan untuk mendeteksi reaksi silang tersebut, tetapi telah tersedia metode pemeriksaan infeksi ricketsia yang baru yang lebih spesifik sehingga tes Weil-Felix tidak dipergunakan lagi.

B. Tes Aglutinasi partikel

Teknik pemeriksaan serologis yang mendeteksi antibodi melalui aglutinasi dari partikel pembawa (carrier) tiruan dimana antigen terikat pada partikel tersebut. Carrier yang biasa digunakan partikel lateks atau sel darah merah yang telah di olah, atau biologic carrier seperti sel bakteri yang dapat membawa antigen pada permukaannya dan dapat berikatan dengan antibodi yang diproduksi sebagai respon dari sel hospes. Ukuran partikel pembawa memungkinkan reaksi aglutinasi dapat terlihat. Contohnya untuk antigen cryptococcal digunakan lateks bead yang dilekati antibodi spesifik pada metode lateks agglutination.

Untuk mendeteksi streptococcus grup A dari swab tenggorok , digunakan metode pemeriksaan aglutinasi partikel untuk grup β-hemolitik streptococcus. Hasil aglutinasi dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya jumlah dan afinitas konjugat antigen terhadap carrier, waktu inkubasi dengan serum penderita dan interaksi yang terjadi pada lingkungan mikro (pH dan konsentrasi protein). Tes komersial telah dikembangkan sebagai satu kesatuan lengkap dengan pelarut, kontrol dan wadah tersendiri. Untuk hasil yang akurat harus digunakan sebagai kesatuan tidak bisa dimodifikasi atau digantikan dengan reagen lain. Apabila tes digunakan untuk specimen LCS misalnya, tidak dapat digunakan untuk pemeriksaan specimen serum kecuali ada teknik prosedur yang disajikan didalamnya dan telah distandarisasi untuk digunakan.

Sel darah merah binatang biasa juga digunakan sebagai carrier antigen pada tes aglutinasi, tes ini disebut dengan haemaglutinasi untuk mendeteksi adanya partikel virus berdasarkan sifat mengaglutinasikan eritrosit yang terlihat secara makroskopis dan indirect haemaglutinasi atau haemaglutinasi pasif, karena bukan merupakan antigen sel darah merah itu sendiri, tetapi sebagai sel pembawa antigen secara pasif, yang akan diikat oleh antibodi. Yang digunakan secara luas dari metode ini dan telah tersedia secara komersial adalah Mikrohaemaglutinasi untuk antibodi Treponema pallidum (MHA-TP), Haemaglutinasi treponemal untuk syphilis (HATTS), haemaglutinasi pasif untuk antibodi terhadap antigen ekstraseluler steptococcus , dan tes indirek haemaglutinasi untuk antibodi virus Rubella, eritrosit diolah dengan penambahan formaldehid-piruvat aldehid sehingga virus rubella dapat terabsorpsi pada membrane permukaan eritrosit . Pedoman laboratorium terpercaya seperti Center for Disease Control and Prevention (CDC) juga menyelenggarakan pemeriksaan indirek haemaglutinasi untuk tes antibodi terhadap beberapa clostridia, Burkholderia psudomallei, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheria, Leptospira dan beberapa agen virus dan parasit.

Contoh pemeriksaan aglutinasi partikel:

ASI Color Mono II test merupakan tes aglutinasi untuk pemeriksaan kualitatif dan semikunatitatif untuk mendeteksi antibodi heteropil serum yang berhubungan dengan Mononukleus infeksiosa (IM). Tidak diperlukan pengenceran sampel.

Prinsip pemeriksaan:

Tes didasarkan reaksi antara antibodi IM dalam sampel bereaksi dengan antigen yang dilekatkan pada eritrosit kuda dan diberi indikator warna. Apabila dalam sampel terdapat antibodi heterofil akan terjadi aglutinasi yang menunjukkan hasil positif apabila tidak ada antibodi, tidak terjadi aglutinasi (hasil tes negatif)


Gambar contoh reaksi aglutinasi Positif (1) dan negatif (2)

Sumber www.dshs.state.tx.us/LAB/serology_cf.shtm

Tes Haemaglutinasi

Digunakan untuk pemeriksaan

- Virus influenza dan virus lainnya

- Pemeriksaan protein : Neuramidase , Haemaglutinin ( yang secara spesifik terikat pada sel eritrosit)


Langkah-langkah pemeriksaan:
1. Pemipetan larutan pengencer.
2. Tambahkan eritrosit dan aduk secara perlahan sampai homogen.
3. Biarkan sel eritrosit tenang dan amati pola susunan eritrosit.
4. Amati apakah sel normal mengendap atau ada aglutinasi dengan mengamati apakah terbentuk seperti kancing pada dasar mikrotiter plate atau terbentuk suspensi eritrosit yang terlarut .

Haemaglutinasi inhibisi

Pada umumnya virus yang menginfeksi manusia dapat berikatan dengan sel darah merah dari spesies yang berbeda. Sebagai contoh partikel virus rubella dapat berikatan dengan sel darah manusia tipe O, angsa atau eritrosit ayam dan menyebabkan aglutinasi sel darah merah. Virus influenza dan parainfluenza dapat mengaglutinasikan eritrosit babi, ayam dan manusia tipe O, arbovirus dapat mengaglutinasikan eritrosit angsa, adenovirus dapat mengaglutinasikan eritrosit tikus atau sel rhesus kera, virus mumps berikatan dengan eritrosit kera, virus herpes dan cytomegalovirus mengaglutinasikan eritrosit domba.

Tes serologi untuk mendeteksi adanya antibodi berbagai virus tersebut berdasarkan kemampuan aglutinasi virus. Serum pasien yang telah diolah dengan penambahan kaolin atau heparin-magnesium chloride (untuk menghilangkan inhibitor nonspesifik dan nonspesifik agglutinin sel eritrosit) ditambahkan ke dalam system yang mengandung virus tersangka penyebab penyakit. Apabila serum mengandung antibodi terhadap virus, akan terbentuk kompleks dan akan menghalangi binding-site permukaaan virus. Ketika sel eritrosit ditambahkan ke dalam larutan seluruh partikel virus akan terikat pada antibodi, sehingga akan mencegah virus mengaglutinasikan eritrosit. Sehingga serum pasien dikatakan positif untuk tes haemaglutination inhibition antibodi

Gambar Reaksi pada tes haemaglutinasi inhibisi

C. Tes flokulasi

Berbeda dengan pembentukkan agregat ketika partikel antigen berikatan dengan antibodi spesifik, interaksi antara antigen terlarut dengan antibodi akan membentuk presipitat, pemadatan partikel halus, biasanya terlihat hanya jika presipitat tetap stabil berada pada matrik.

Ada dua jenis tes berdasarkan flokulasi:

1). Tes Presipitin

Metode klasik untuk mendeteksi antigen terlarut yaitu antigen dalam suatu larutan adalah Outcherlony double immunodiffusion. Pada metode ini sumur dibuat dalam suatu agar, suatu matrik berbentuk gelatin yang memungkinkan partikel berdifusi dalam cawan petri. Metode ini biasanya digunakan untuk mendeteksi eksoantigen yang diproduksi oleh jamur sistemik untuk konfirmasi keberadaannya dalam pembiakan. Akan tetapi teknik ini terlalu lambat untuk penggunaan secara umum untuk deteksi antigen secara langsung dari specimen serum pasien.

Contoh hasil double immunodiffusi dan imunopresipitasi

Imunodiffusi

Tes imunodifusi didasarkan pada pembentukkan imunokompleks yang berdasarkan berat molekul yang tinggi, presipitat dan bentuk garis presipitasi dapat diamati secara makroskopik. Metode ini untuk mendapatkan hasil diperoleh kurang lebih satu minggu itupun hanya hasil kualitatif. Teknik imunodifusi dapat dilakukan pada cawan petri yang mengandung agar gelatin 1% dalam suasana buffer posfat atau tris buffer. Sumur-sumur dibuat menggunakan perforator, untuk menempatkan antigen di sumur dan serum-serum diletakkan mengeliligi antigen. Antigen dan antibodi dalam serum akan berdifusi dalam agar dan ketika bertemu akan membentuk garis agak kabur yang akan terlihat pada cahaya langsung dan dengan latar belakang gelap. Kontrol positif (standar serum) harus disertakan untuk panduan pembacaan hasil positif dan interpretasi. Teknik imunodifusi selain untuk serum juga dapat digunakan untuk LCS dan urine. Teknik imunodifusi biasa digunakan pula untuk deteksi antibodi terhadap jamur pathogen : Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides, Paracoccidioides, dan beberapa jamur opportunistic yang pemeriksaannya memerlukan waktu sekurang-kurangnya 48 jam bahkan lebih untuk mengembangkan pembentukan pita .

Gambar contoh hasil imunodifusi yang positif untuk paracoccidioidomycosis (a) dan hasil positif pada reaksi aglutinasi latek pada sumur atas dan hasil negatif pada sumur di bawah (b)

VDRL (Veneral Disease Research Laboratory test)

Merupakan metode yang menggunakan prinsip presipitasi dengan bentuk produk akhir presipitin berkumpul terlihat secara makroskopis dan mikroskopis. Pasien yang terinfeksi treponema, pada umumnya Treponema. pallidum, penyebab shypilis membentuk antibodi seperti protein dinamakan reagin yang akan berikatan dengan antigen cardiolipin-lecithin-coated cholesterol partikel, menyebabkan partikel berflokulasi. Karena reagin bukan merupakan antibodi langsung yang spesifik terhadap antigen T. pallidum, tes ini kurang spesifik tetapi baik digunakan untuk skrining tes. VDRL merupakan satu-satunya tes yang paling berguna untuk mendeteksi cairan LCS pasien tersangka Neuroshypilis, meskipun kemungkinan terjadi positif palsu. Pelaksanaan tes VDRL memerlukan ketelitian, alat gelas yang bersih, dan harus memperhatikan rincian secara tepat, termasuk kontrol kualitas rutin. Sebagai tambahan, reagen yang akan digunakan harus disiapkan baru setiap pelaksanaan tes, serum pasien harus diinaktivasi dengan pemanasan selama 30 menit pada 56C sebelum tes, dan hasilnya dibaca menggunakan mikroskop. Untuk semua alasan tersebut banyak laboratorium klinik menggunakan tes kualitatif tandingan Rapid Plasma Reagin (RPRtest)

RPR (Rapid Plasma Reagin test)

RPR merupakan tes yang tersedia secara komersial lengkap dengan konrol positif dan negatif, kartu tempat reaksi, dan reagen untuk persiapan suspensi antigen. Antigen kardiolipin-lecithin-coated cholesterol dengan cholin klorida dan juga mengandung partikel arang untuk memperlihatkan flokulasi makroskopis. Serum tanpa pemanasan dan reaksi terjadi pada permukaan kartu tes yang kemudian dibuang. RPR merupakan tes yang dianjurkan untuk specimen LCS. Seluruh prosedur distandarisasi dan dijelaskan terperinci dalam kit reagen dan harus diikuti dengan tepat. Secara keseluruhan RPR merupakan tes skrining yang lebih sensitif dibandingkan VDRL, dan lebih mudah dalam pengerjaannya. Beberapa modifikasi telah dibuat, misalnya penggunaan zat warna untuk mempermudah melihat hasil reaksi.

Kondisi dan infeksi lain selain shypilis yang dapat menyebabkan hasil positif pada pemeriksaan VDRL atau RPR disebut biologic false positive tes. Penyakit autoimun, seperti lupus erythematosus dan demam reumatik, mononucleosis infeksiosa, hepatitis, kehamilan dan usia tua,dapat menyebabkan positif palsu sehingga untuk hasil positif dinyatakan sebagai dugaan dan harus dikonfirmasi dengan tes spesifik treponemal.

Tes RPR

Contoh : BD Macro-Vue™ RPR Card Test Kits

Sumber : www.cardinalhealth.com/.../images/B/B6940-9.jpg

BD Macro-Vue™ RPR (rapid plasma reagin) merupakan tes nontreponemal untuk mendeteksi shypilis, terdiri dari reagen tetes, kartu tes berdiameter 18 mm dan prosedur yang tercantum dalam A Manual of Tests for Syphilis (Larsen, S., et al., editors, 1990, American Public Health Association).

Gambar Rotator untuk RPR

Sumber : websites.labx.com/rankin/pics/41747.JPG

BD Macro-Vue Card Test Rotator model 51-II. Merupakan rotator yang digunakan pada metodeith Macro-Vue circle card tests. Rotator dengan kecepatan rotasi konstan 100 rpm dengan diameter lingkaran kartu tes 2 cm. waktu yang dibutuhkan selama 8 menit dan akan terdengar suara bel apabila telah mencukupi waktu yang telah ditentukan. 115V, 60 Hz.

Gambar pengenceran serum RPR kuantitatif

Sumber :student.ccbcmd.edu/.../lab18/images/rprdil.jpg

2). Counterimmunoelectrophoresis

Jenis tes lain yang menggunakan prinsip presipitasi dan penggunaannya secara luas digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam jumlah sedikit. Kelebihan tes ini menggunakan muatan listrik yang dialirkan pada antigen-antibodi yang dites pada sistem buffer tertentu. Karena antigen dan antibodi dipertemukan satu sama lainnya dengan bantuan arus listrik pada suatu matriks semisolid untuk bermigrasi sehingga metode ini disebut Counterimmunoelectrophoresis (CIE). CIE merupakan modifikasi metode Ouchterlony yang dipercepat migrasi antigen antibodinya oleh adanya aliran listrik. Dengan pengecualian bakteri Streptococcus pneumonia serotype 7 dan 14, antigen bakteri akan bermuatan negatif pada suasana sedikit basa, sedangkan antibodi bersifat netral. Sifat antigen bakteri inilah yang digunakan pada prinsip metode CIE, dimana larutan yang mengandung antibodi dan larutan sampel diletakkan pada lubang sumur agarosa yang diletakkan pada permukaan kaca. Kertas atau fiber bersumbu digunakan untuk menjembatani dua agarosa yang bersebrangan untuk dilalui buffer yang sedikit alkali. Ketika dialiri arus listrik maka akan terjadi migrasi dari Antigen yang bermuatan negatif akan bermigrasi ke elektoda positif. Antibodi yang bermuatan netral akan terbawa oleh elektroda negatif . pada perbatasan antara sumur akan terbentuk zona ekuivalen, dan komplek antigen-antibodi membentuk garis presipitasi yang nampak, proses migrasi ini memerlukan waktu satu jam. Banyak antigen yang dapat diperiksa oleh metode CIE, mendeteksi hampir 0,01 sampai 0,05 mg/ml antigen yang setara dengan 103 organisme/ml larutan. Perlu disertai control pada setiap pengerjaan, CIE merupakan metode yang berdasarkan reaksi presipitasi yang cukup mahal, sehingga tidak banyak digunakan lagi dalam imunodiagnostik.

D. Tes Netralisasi

Tes netralisasi pada kultur sel dan pengujian laboratorik menggunakan hewan coba, antibody akan mencegah atau menurunkan virulensi virus. Teknik ini sulit dan membutuhkan waktu pengerjaan yang lama dan sulit untuk dikerjakan, akan tetapi kadangkala diperlukan.

.

Gambar tahapan tes netralisasi virus

E. Tes Fiksasi komplemen

Tes fiksasi komplemen merupakan teknik imunologi yang digunakan untuk menentukan antigen spesifik atau antibody apabila ada dalam serum pasien. Metode ini sangat umum digunakan untuk membedakan dan menemukan penyebab infeksi. Pada umumnya digunakan untuk pemeriksaan mikroorganisme yang sulit di identifikasi melalui metode pembiakan. Akan tetapi metode ini telah tergantikan oleh metode serological lainnya dalam dignosa klinik seperti ELISA dan metoda identifikasi patogen yang didasarkan pada DNA khususnya polymerase chain reaction (PCR)

Pada teknik fiksasi komplemen, komplemen digunakan ketika antigen bereaksi dengan antibodi. Komplemen dapat ditemukan pada serum babi Guinea. Ketika sel darah merah ditambahkan dengan anti-red-cell-antibody, sel darah merah akan lisis ketika ditambahkan komplemen (hasil tes negatif). Apabila dalam serum mengandung antibodi maka complemen akan menfiksasi ikatan antigen dan antibodi sehingga ketika ditambahkan anti-red-cell antibodi tidak menghasilkan hemolisis sehingga tes menunjukkan hasil positif.


Reaksi pada teknik fiksasi komplemen

Contoh pemeriksaan dengan metode fiksasi komplemen

  1. Adenovirus
  2. Jamur (Blastomyces, Coccicioides, & Histoplasma)
  3. Virus Influenza A & B
  4. Parainfluenza 1, 2, & 3
  5. Poliovirus 1, 2, & 3
  6. Respiratory Syncitial Virus (RSV)

F. ELISA (Enzyme Linked Immunoassays)/EIA (Enzym Immunoassays)

ELISA digunakan untuk pengukuran konsentrasi antibody terhadap suatu antigen, biasanya digunakan antibody monoclonal.

Persiapan tes:

- Antigen dilekatkan pada fase padat misalnya pada permukaan dasar mikroplate

- Persiapan anti-human antibody dilabel enzim (contohnya β-galaktosida) yang berfungsi sebagai indicator warna dari substrat yang jernih.

Prinsip ELISA

Cara kerja :

- Specimen yang akan diperiksa dimasukkan ke dalam sumur biasanya mikroplate, molekul antibody akan berikatan dengan antigen yang dilekatkan pada fase padat

- Anti-human antibody yang diberi label ditambahkan pada campuran. Antibody berlabel akan terikat pada ikatan molekul antigen-antibodi yang pertama sehingga terjadi ikatan sandwich antibody-antigen-antibody berlabel

- Setelah proses pencucian molekul yang tidak berikatan, ditambahkan substrat

- Setelah beberapa waktu sesuai dengan standar prosedur, ditambahkan reagen untuk menghentikan reaksi (penambahan NaOH 1N). intensitas warna yang terbentuk proporsional/ sebanding dengan konsentrasi antigen yang terikat.

Contoh teknik ELISA dan imunoblot

G. Indirect Flourescent Antibodi Test (IFA)

Pemeriksaan yang berdasarkan IFA ke dalam analisis serologi dan molekular :

  • Ehrlichia antibody
  • Fluorescent Treponemal antibody (FTA)
  • Legionnella antibody
  • Mumps IgM antibody
  • Q Fever antibody
  • Rocky Mountain Spotted Fever antibody
  • Toxoplasma IgG antibody
  • Typhus antibody

Teknik Fluorescent-antibody (FA) masih digunakan untuk mendeteksi antigen dan antibodi walaupun tidak sebanyak EIA. Teknik fluorescent terdiri dari direct dan indirect, metode indirek biasanya digunakan untuk mendeteksi antibodi (IFA) seperti pada EIA, sedangkan untuk pemeriksaan antigen digunakan metode direk.

Indirect Fluorescent Antibody Test (IFA)

1. Antigen mikroba diletakkan dalam kaca objek dan diberi bahan fiksatif

2. Serum pasien yang telah diencerkan diinkubasi bersama antigen pada kaca objek, kemudian dicuci

3. Antibodi berlabel flouresen (konjugat) ditambahkan

4. Kaca objek dicuci hemudian dikeringkan, kemudian dibaca dibawah mikroskop flouresen

Preparat diamati adanya area terang berfloresensi warna hijau dan dibandingkan dengan control positif dan negatif. Adanya floresensi hijau menandakan adanya antibodi terhadap antigen

Contoh teknik IFA untuk antibodi toxoplasma. Pada lapang pandang kiri hasil positif, sedangkan kanan hasil negatif

Contoh tes IFA untuk antibodi ehrlichia . Ehrlichiae adalah obligat intraseluler rickettsiae, penyebab penyakit seperti Rocky Mountain Spotted Fever.


H. Immunoprecipitasi
Imunopresipitasi merupakan metode dimana protein antigen dipresipitasikan dalam larutan menggunakan antibodi spesifik yang berikatan dengan protein antigen tersebut. Metode ini dapat digunakan ketika isolasi dan pemadatan protein spesifik pada bahan pemeriksaan terdiri dari berbagai macam protein dan tidak sejenis. Antibodi harus dilekatkan pada fase padat pada saat yang sama pada teknik pemeriksaan.


J. Immunoblot

Immunoblot disebut juga dengan Western Blot adalah suatu metoda analisa. Mendeteksi protein tertentu yang terdapat pada sampel ekstrak atau jaringan. Pada teknik imunoblot, protein didenaturasi, rantai panjang polipeptida atau struktrur tiga dimensi protein dengan elektroforesis. Setelah protein dipindahkan ke dalam membrane nitroselulosa, protein dideteksi dengan penambahan antibodi. Setiap protein akan berikatan dengan antibodi yang digunakan untuk mendeteksi adanya antigen. Sebuah indicator spesifik digunakan untuk melabel antibodi yang akan menimbulkan warna setelah bereaksi dengan streptavidin.



K. Pemeriksaan biologi molecular

Misalnya : PAGE atau SDS PAGE (sodium dodecyl sulfate poliacrylamide gel electrophoresis) adalah metode yang biasanya digunakan untuk biokimia, forensik, genetik dan biologi molekular. Metode ini menggunakan teknik pemisahan protein berdasarkan kemampuan pergerakan molekul dalam elektroforesis

L. Teknik pemeriksaan lainnya
Protein sequencing dan X-ray crystallography digunakan untuk analisis protein virus. Sedangkan teknik Agarose gels, restriction analysis, sequencing, southern blot, northern blot, PCR atau RT-PCR biasanya digunakan untuk analisa genom virus.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar